Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – FISH là gì?

Khi đọc kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh hoặc xét nghiệm sinh học phân tử, bác có thể gặp thuật ngữ FISH. Đây là một kỹ thuật được sử dụng khá nhiều trong ung thư học, đặc biệt khi bác sĩ cần tìm một số gene fusion, rearrangement hoặc tình trạng tăng số bản sao của gene.

FISH không giống PCR và cũng không giống giải trình tự gene. Nếu PCR thường tập trung khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, còn giải trình tự tìm kiếm thông tin trong trình tự DNA, thì FISH sử dụng những đầu dò DNA phát huỳnh quang để tìm và quan sát một vùng gene hoặc nhiễm sắc thể ngay trong tế bào.

Có thể hình dung đơn giản rằng PCR giống như việc “phóng đại” một đoạn DNA để máy xét nghiệm dễ phát hiện, còn FISH giống như việc dùng một chiếc đèn đánh dấu để tìm đúng vị trí của gene ngay bên trong tế bào.

Nhờ đặc điểm này, FISH có thể cung cấp thông tin không chỉ về việc một gene có bất thường hay không mà còn về vị trí và sự sắp xếp của gene trong nhiễm sắc thể.

1. FISH là gì?

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ.

“In situ” có nghĩa là tại chỗ, tức là xét nghiệm được thực hiện trên tế bào hoặc mô và cho phép quan sát vị trí của vật liệu di truyền ngay trong tế bào.

“Hybridization” là quá trình một đoạn DNA được thiết kế đặc hiệu, gọi là probe (đầu dò), tìm và gắn vào trình tự DNA bổ sung của nó.

“Fluorescence” nghĩa là đầu dò được gắn với chất phát huỳnh quang. Khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, vị trí mà đầu dò gắn vào sẽ phát ra tín hiệu.

Nhờ đó, bác sĩ giải phẫu bệnh hoặc chuyên gia xét nghiệm có thể quan sát xem gene hoặc vùng nhiễm sắc thể cần tìm nằm ở đâu và có số lượng hoặc sự sắp xếp bất thường hay không.

2. FISH hoạt động như thế nào?

Về cơ bản, FISH trải qua một số bước chính.

Trước hết, tế bào hoặc mô bệnh phẩm được chuẩn bị trên lam kính. DNA trong tế bào được xử lý để hai mạch DNA tách ra.

Sau đó, các đầu dò DNA đặc hiệu được đưa vào mẫu. Mỗi đầu dò được thiết kế để nhận diện một trình tự DNA nhất định và được gắn với một chất phát huỳnh quang.

Nếu trình tự DNA mục tiêu có mặt và phù hợp với đầu dò, đầu dò sẽ gắn vào vị trí đó.

Cuối cùng, mẫu được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Các tín hiệu phát sáng giúp xác định vị trí và số lượng tín hiệu tương ứng với vùng gene được khảo sát.

Điểm đặc biệt của FISH là người ta có thể quan sát sự phân bố của gene trong từng tế bào.

3. Probe là gì?

Probe, hay đầu dò, là một đoạn DNA ngắn được thiết kế để nhận diện một trình tự DNA cụ thể.

Có thể hình dung probe giống như một “miếng nam châm” được thiết kế riêng cho một vị trí DNA nhất định.

Nếu trình tự mục tiêu có mặt, probe sẽ gắn vào đó và tạo ra tín hiệu huỳnh quang.

Tùy mục đích xét nghiệm, probe có thể được thiết kế để đánh dấu một gene cụ thể, hai gene khác nhau hoặc vùng DNA ở hai phía của một gene.

Chính cách thiết kế probe quyết định rất nhiều đến câu hỏi mà FISH có thể trả lời.

Vì vậy, cũng giống như PCR, FISH không phải một xét nghiệm duy nhất. Hai xét nghiệm FISH khác nhau có thể sử dụng những probe khác nhau và trả lời những câu hỏi hoàn toàn khác nhau.

4. FISH có thể phát hiện những bất thường gene nào?

FISH có thể được sử dụng để phát hiện một số loại bất thường di truyền hoặc nhiễm sắc thể, trong đó thường gặp là:

Gene rearrangement, tức tái sắp xếp gene.

Gene fusion, tức hai vùng gene vốn tách biệt bị nối với nhau.

Gene amplification, tức số lượng bản sao của một gene tăng lên bất thường.

Ngoài ra, FISH còn có thể được sử dụng để phát hiện một số bất thường về số lượng nhiễm sắc thể hoặc mất một vùng nhiễm sắc thể nhất định.

Điểm mạnh của FISH là nó cho phép khảo sát sự thay đổi về vị trí, số lượng hoặc mối quan hệ giữa các vùng DNA ngay trong tế bào.

5. FISH phát hiện gene fusion như thế nào?

Đây là một trong những ứng dụng quan trọng của FISH trong ung thư học.

Giả sử có hai gene A và B nằm ở những vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể. Trong một số tế bào ung thư, một biến đổi nhiễm sắc thể có thể khiến hai gene này được nối lại với nhau.

Phòng xét nghiệm có thể sử dụng hai probe khác màu, một probe nhận diện gene A và một probe nhận diện gene B.

Ở tế bào bình thường, hai tín hiệu có thể nằm tách biệt.

Nếu xảy ra fusion hoặc rearrangement phù hợp với thiết kế xét nghiệm, vị trí của hai tín hiệu sẽ thay đổi hoặc hai tín hiệu có thể nằm rất gần nhau, tạo thành một kiểu hình tín hiệu đặc trưng.

Từ đó, chuyên gia có thể xác định liệu có bằng chứng phù hợp với rearrangement hoặc fusion đang được tìm kiếm hay không.

6. FISH break-apart là gì?

Một kỹ thuật FISH rất thường gặp trong ung thư học là break-apart FISH.

Thay vì sử dụng hai probe để đánh dấu hai gene khác nhau, break-apart FISH sử dụng hai probe đánh dấu hai vùng nằm ở hai phía của cùng một gene.

Ở trạng thái bình thường, hai vùng này nằm gần nhau nên các tín hiệu huỳnh quang thường nằm gần hoặc chồng lên nhau.

Nếu gene bị rearrangement, hai vùng có thể bị tách ra. Khi đó, hai tín hiệu huỳnh quang cũng tách xa nhau.

Mẫu hình này được gọi là break-apart, tức hai tín hiệu “tách đôi”.

Ưu điểm của phương pháp này là có thể phát hiện sự tái sắp xếp của một gene mục tiêu mà không nhất thiết phải biết chính xác gene đối tác của nó.

Tuy nhiên, FISH break-apart vẫn chỉ cho biết có bằng chứng về rearrangement của gene đang được khảo sát. Nó không phải lúc nào cũng xác định được gene đối tác cụ thể.

7. FISH có phát hiện được ALK rearrangement không?

Có.

ALK là một ví dụ kinh điển về ứng dụng của FISH trong ung thư phổi.

Một số ung thư phổi không tế bào nhỏ có thể xuất hiện ALK rearrangement, thường liên quan đến sự hình thành một gene fusion dẫn đến hoạt hóa bất thường đường truyền tín hiệu ALK.

FISH có thể sử dụng probe break-apart để đánh giá sự tái sắp xếp của vùng ALK.

Nếu mẫu xuất hiện kiểu tín hiệu phù hợp với tiêu chuẩn của xét nghiệm, kết quả có thể được báo cáo là có bằng chứng về ALK rearrangement.

Tuy nhiên, trong thực hành hiện nay, ALK có thể được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn hóa mô miễn dịch, FISH hoặc NGS, tùy bối cảnh và khả năng của phòng xét nghiệm.

8. FISH có giống xét nghiệm ALK bằng hóa mô miễn dịch không?

Không.

Hai xét nghiệm này khảo sát hai mức độ khác nhau của sinh học khối u.

Hóa mô miễn dịch, hay IHC, sử dụng kháng thể để phát hiện protein ALK trong tế bào.

FISH sử dụng probe DNA để tìm bất thường về gene hoặc nhiễm sắc thể, chẳng hạn ALK rearrangement.

Do đó, một xét nghiệm nhìn vào protein, còn xét nghiệm kia nhìn vào vật liệu di truyền.

Trong một số tình huống, IHC có thể được sử dụng như phương pháp sàng lọc hoặc xét nghiệm xác định tùy loại biomarker và hướng dẫn hiện hành. FISH có thể được sử dụng khi cần đánh giá trực tiếp rearrangement ở mức DNA.

9. FISH có phát hiện HER2 amplification không?

Có.

FISH là một phương pháp quan trọng để đánh giá HER2 gene amplification, đặc biệt trong ung thư vú và một số ung thư khác khi kết quả hóa mô miễn dịch HER2 chưa rõ ràng hoặc cần được đánh giá ở mức gene.

Trong xét nghiệm FISH HER2, người ta thường sử dụng probe đánh dấu gene HER2 và một probe tham chiếu liên quan đến nhiễm sắc thể 17.

Sau khi quan sát nhiều tế bào, chuyên gia có thể đánh giá số lượng tín hiệu và tỷ lệ giữa HER2 với tín hiệu tham chiếu.

Nếu số lượng bản sao HER2 tăng lên đáng kể so với mức tham chiếu theo tiêu chuẩn của phương pháp, có thể có bằng chứng về HER2 amplification.

Điều này minh họa rất rõ sự khác nhau giữa IHC và FISH. IHC đánh giá lượng protein HER2, trong khi FISH đánh giá số lượng bản sao gene HER2.

10. FISH có thể phát hiện gene fusion trong ung thư nào?

FISH được sử dụng trong nhiều bệnh ung thư và bệnh lý huyết học khác nhau.

Trong ung thư phổi, FISH từng được sử dụng rộng rãi để phát hiện một số rearrangement như ALK hoặc các bất thường gene khác.

Trong bệnh lý huyết học, FISH có vai trò rất quan trọng trong việc phát hiện nhiều bất thường nhiễm sắc thể và gene fusion liên quan đến chẩn đoán, phân loại và tiên lượng bệnh.

Ví dụ, trong một số bệnh bạch cầu và lymphoma, FISH có thể được sử dụng để tìm những rearrangement đặc trưng có giá trị chẩn đoán hoặc phân loại.

Trong ung thư vú, FISH có thể được sử dụng để đánh giá HER2 amplification.

Trong các bệnh ung thư khác, FISH có thể được thiết kế để khảo sát những gene hoặc vùng nhiễm sắc thể phù hợp với đặc điểm bệnh.

11. FISH khác PCR như thế nào?

PCR và FISH đều là kỹ thuật sinh học phân tử nhưng cách tiếp cận khác nhau.

PCR chủ yếu khuếch đại một vùng DNA mục tiêu, sau đó sử dụng tín hiệu hoặc phân tích sản phẩm PCR để xác định mục tiêu.

FISH sử dụng probe huỳnh quang để đánh dấu trực tiếp vùng DNA mục tiêu trong tế bào và quan sát dưới kính hiển vi.

PCR có ưu thế khi cần phát hiện một trình tự hoặc biến thể cụ thể với độ nhạy cao.

FISH có ưu thế khi cần đánh giá vị trí, số lượng hoặc sự tách rời của các vùng gene trong tế bào.

Có thể hình dung PCR giống như việc lấy một đoạn DNA ra để nhân bản thật nhiều nhằm kiểm tra. FISH giống như việc đánh dấu màu lên những vị trí gene cần tìm rồi quan sát chúng trực tiếp trên bản đồ nhiễm sắc thể của từng tế bào.

12. FISH khác NGS như thế nào?

NGS có khả năng khảo sát đồng thời nhiều gene và nhiều vùng DNA, tùy theo thiết kế của panel.

FISH thường tập trung vào một bất thường hoặc một nhóm bất thường đã được xác định trước.

Ví dụ, nếu bác sĩ chỉ cần biết một gene cụ thể có bị rearrangement hay không, một xét nghiệm FISH phù hợp có thể trả lời trực tiếp câu hỏi đó.

Nếu bác sĩ muốn khảo sát đồng thời nhiều gene để tìm các đột biến, fusion, amplification hoặc những thay đổi khác, NGS có thể cung cấp phạm vi thông tin rộng hơn.

Tuy nhiên, NGS cũng không phải lúc nào cũng thay thế hoàn toàn FISH. Một số bất thường nhiễm sắc thể có thể được đánh giá rất trực quan bằng FISH và kỹ thuật này vẫn có giá trị trong những tình huống phù hợp.

Do đó, FISH và NGS có thể bổ sung cho nhau, thay vì đơn giản coi một phương pháp là tốt hơn phương pháp kia.

13. FISH có cần giải trình tự DNA không?

Không.

Đây là một điểm khác biệt quan trọng.

FISH không đọc toàn bộ trình tự DNA theo từng nucleotide. Nó sử dụng probe để xác định một vùng DNA hoặc mối quan hệ giữa các vùng DNA đã được lựa chọn trước.

Vì vậy, FISH có thể cho biết một gene có bị rearrangement hoặc amplification hay không, nhưng thường không cung cấp toàn bộ thông tin về trình tự DNA của gene đó.

Nếu cần xác định chính xác trình tự hoặc tìm nhiều loại biến thể trong nhiều gene, các phương pháp giải trình tự như NGS có thể phù hợp hơn.

14. FISH có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm nào?

FISH có thể được thực hiện trên nhiều loại bệnh phẩm có tế bào hoặc nhân tế bào phù hợp để phân tích.

Trong ung thư, mẫu thường có thể là mô sinh thiết, bệnh phẩm phẫu thuật hoặc mẫu tế bào học, tùy loại xét nghiệm.

Trong bệnh lý huyết học, FISH có thể được thực hiện trên tế bào máu hoặc tủy xương trong những trường hợp phù hợp.

Chất lượng mẫu và khả năng bảo tồn nhân tế bào có vai trò quan trọng. Nếu mẫu quá ít tế bào hoặc chất lượng không đảm bảo, việc phân tích tín hiệu FISH có thể gặp khó khăn.

Đây là một trong những lý do bác sĩ cần đánh giá chất lượng bệnh phẩm trước khi quyết định phương pháp xét nghiệm.

15. FISH dương tính có nghĩa là gì?

FISH dương tính nghĩa là mẫu bệnh phẩm xuất hiện mẫu hình tín hiệu phù hợp với bất thường mà xét nghiệm được thiết kế để tìm, theo tiêu chuẩn của phương pháp.

Ví dụ, nếu xét nghiệm FISH được thiết kế để tìm ALK rearrangement và kết quả dương tính, điều đó cho thấy có bằng chứng về sự tái sắp xếp ALK trong mẫu được phân tích.

Nếu xét nghiệm FISH được thiết kế để đánh giá HER2 amplification và kết quả phù hợp với tiêu chuẩn amplification, điều đó cho thấy số lượng bản sao HER2 tăng bất thường theo tiêu chí của xét nghiệm.

Nhưng FISH dương tính không nên được hiểu đơn giản là “gene này bị đột biến”. FISH có thể đang phát hiện rearrangement, amplification, mất đoạn hoặc một bất thường nhiễm sắc thể khác.

Muốn hiểu chính xác kết quả, phải xem loại probe và tiêu chí đánh giá.

16. FISH âm tính có nghĩa là gì?

FISH âm tính có nghĩa là không phát hiện được mẫu hình bất thường mà xét nghiệm được thiết kế để tìm.

Ví dụ, FISH ALK âm tính có nghĩa là xét nghiệm không phát hiện được ALK rearrangement theo tiêu chuẩn của phương pháp.

Điều này không đồng nghĩa với việc toàn bộ gene ALK hoàn toàn bình thường.

Tương tự, một FISH được thiết kế để tìm một fusion cụ thể không thể loại trừ tất cả những fusion khác.

Nếu nghi ngờ lâm sàng hoặc bệnh lý vẫn cao, bác sĩ có thể cân nhắc phương pháp khác phù hợp hơn.

17. FISH có phát hiện được mọi gene fusion không?

Không.

Đây là một giới hạn quan trọng.

FISH cần có probe được thiết kế cho vùng gene mà người ta muốn khảo sát.

Nếu phòng xét nghiệm chỉ sử dụng probe cho một gene nhất định, xét nghiệm có thể phát hiện rearrangement của gene đó nhưng không thể tự động phát hiện mọi fusion trong toàn bộ bộ gene.

Ví dụ, một xét nghiệm FISH break-apart có thể phát hiện rằng gene X bị rearrangement, nhưng không nhất thiết cho biết gene X đã hợp nhất với gene Y hay gene Z.

Nếu cần tìm đồng thời nhiều fusion khác nhau hoặc xác định chính xác đối tác fusion, NGS hoặc một phương pháp phân tử khác có thể cung cấp thêm thông tin.

18. FISH có thể cho biết gene fusion cụ thể là gene nào với gene nào không?

Có thể, nhưng phụ thuộc vào thiết kế xét nghiệm.

Nếu sử dụng hai probe được thiết kế để nhận diện hai gene cụ thể, FISH có thể cung cấp bằng chứng về sự liên quan giữa hai vùng gene đó.

Ngược lại, nếu sử dụng break-apart FISH, xét nghiệm chủ yếu cho biết gene mục tiêu có bị rearrangement hay không.

Ví dụ, một break-apart FISH cho ALK có thể cho biết ALK bị rearrangement, nhưng bản thân xét nghiệm đó không nhất thiết xác định được ALK đã fusion với gene đối tác nào.

Đây là một điểm khác biệt quan trọng khi đọc kết quả FISH.

19. FISH có phải là xét nghiệm di truyền toàn diện không?

Không.

FISH là một xét nghiệm có mục tiêu.

Nó rất hữu ích khi bác sĩ đã có một câu hỏi tương đối rõ ràng, chẳng hạn cần biết một gene có rearrangement hay không hoặc một gene có bị amplification hay không.

Nhưng FISH không khảo sát toàn bộ bộ gene và cũng không phát hiện tất cả các loại đột biến.

Nếu mục tiêu là tìm kiếm rộng nhiều gene và nhiều dạng biến đổi phân tử, NGS thường phù hợp hơn.

Do đó, nếu trên phiếu xét nghiệm ghi “FISH âm tính”, bác không nên hiểu là “không có bất kỳ bất thường gene nào”.

Cách hiểu chính xác hơn là:

“Không phát hiện bất thường mà bộ FISH này được thiết kế để tìm.”

20. Khi nào bác sĩ thường lựa chọn FISH?

FISH đặc biệt hữu ích khi cần trả lời một câu hỏi phân tử cụ thể và đã biết trước vùng gene hoặc nhiễm sắc thể cần khảo sát.

Ví dụ, bác sĩ có thể cân nhắc FISH khi cần đánh giá một rearrangement hoặc fusion cụ thể, kiểm tra gene amplification hoặc khảo sát một bất thường nhiễm sắc thể có giá trị trong chẩn đoán và phân loại bệnh.

Trong một số trường hợp, FISH còn được sử dụng khi kết quả của một xét nghiệm khác chưa rõ ràng và cần một phương pháp bổ sung.

Việc lựa chọn FISH hay PCR, IHC, NGS hoặc phương pháp khác phụ thuộc vào loại ung thư, biomarker cần tìm, loại bệnh phẩm và câu hỏi lâm sàng.

21. Một ví dụ dễ hiểu trong ung thư phổi

Giả sử một người bệnh được chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ và bác sĩ cần đánh giá khả năng có ALK rearrangement.

Một xét nghiệm FISH break-apart có thể sử dụng hai probe đánh dấu hai vùng nằm ở hai phía của gene ALK.

Ở tế bào không có rearrangement, các tín hiệu có xu hướng nằm gần nhau.

Nếu ALK bị rearrangement, hai tín hiệu có thể tách ra theo một mẫu hình đặc trưng. Chuyên gia sẽ đếm và đánh giá các tế bào theo tiêu chuẩn của xét nghiệm để đưa ra kết luận.

Nếu kết quả dương tính, đây là thông tin phân tử có thể có ý nghĩa quan trọng đối với việc lựa chọn điều trị đích trong ung thư phổi ALK-positive.

Nếu kết quả âm tính, điều đó chỉ có nghĩa là xét nghiệm không phát hiện ALK rearrangement theo phương pháp được sử dụng. Nó không có nghĩa là khối u hoàn toàn không có bất kỳ bất thường gene nào khác.

Nếu cần khảo sát rộng hơn, bác sĩ có thể cân nhắc một panel xét nghiệm phân tử khác.

22. Người bệnh nên đọc kết quả FISH như thế nào?

Khi nhận một kết quả FISH, bác không nên chỉ nhìn vào hai chữ “positive” hoặc “negative”.

Trước hết cần xem gene nào đang được khảo sát.

Tiếp theo cần xem xét nghiệm đang tìm rearrangement, fusion, amplification, deletion hay bất thường nào khác.

Sau đó xem phần kết luận của phòng xét nghiệm và tiêu chí đánh giá.

Ví dụ:

ALK rearrangement: Positive

có ý nghĩa rất khác với:

HER2 amplification: Positive

vì hai xét nghiệm đang tìm hai loại bất thường hoàn toàn khác nhau.

Nếu bác được chỉ định FISH, có thể hỏi bác sĩ một câu rất đơn giản:

“Xét nghiệm FISH này đang tìm bất thường gì và nếu dương tính thì kết quả đó có ảnh hưởng đến việc điều trị như thế nào?”

Đây là cách hiểu kết quả thực tế và hữu ích hơn nhiều so với việc chỉ cố nhớ FISH là viết tắt của cụm từ nào.

Kết luận

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ, sử dụng các đầu dò DNA phát huỳnh quang để nhận diện và quan sát những vùng gene hoặc nhiễm sắc thể cụ thể ngay trong tế bào.

Trong ung thư học, FISH có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại bất thường phân tử và nhiễm sắc thể, đặc biệt là gene rearrangement, gene fusion và gene amplification. Một số ứng dụng quen thuộc gồm đánh giá ALK rearrangement trong ung thư phổi và HER2 amplification trong ung thư vú.

FISH có ưu điểm là cho phép quan sát trực tiếp vị trí và sự phân bố của các vùng DNA trong từng tế bào. Tuy nhiên, đây vẫn là một xét nghiệm có mục tiêu. FISH chỉ phát hiện những bất thường nằm trong phạm vi mà các probe của xét nghiệm được thiết kế để khảo sát.

Vì vậy, FISH âm tính không có nghĩa là khối u hoàn toàn không có bất thường gene. Nó chỉ cho biết bất thường mà xét nghiệm FISH đó được thiết kế để tìm không được phát hiện trong mẫu đã phân tích.

FISH cũng khác với PCR và NGS. PCR chủ yếu khuếch đại những vùng DNA mục tiêu, FISH quan sát trực tiếp vị trí và sự sắp xếp của vùng gene trong tế bào, còn NGS có thể khảo sát rộng nhiều gene và nhiều dạng biến đổi tùy theo thiết kế của panel.

Điều quan trọng nhất khi đọc kết quả FISH là không chỉ hỏi “dương tính hay âm tính?”, mà cần biết “đang tìm gene nào, tìm loại bất thường nào và kết quả này có ý nghĩa gì đối với chẩn đoán hoặc điều trị?”

Mời bác đọc bài tiếp theo: Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – Sanger sequencing là gì?

Tài liệu tham khảo

1. National Human Genome Research Institute. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). National Human Genome Research Institute. Cập nhật hiện hành.

2. National Cancer Institute. Fluorescence in Situ Hybridization. NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute. Cập nhật hiện hành.

3. Rao PH, Cigudosa JC, Ning Y, et al. Application of fluorescence in situ hybridization in cancer diagnosis and research. Cancer Genetics and Cytogenetics. 1997;94(2):100-111.

4. Pinkel D, Gray JW, Trask B. Three-color spectral karyotyping. Nature Genetics. 2000;24(2):163-166.

5. Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, et al. Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2018;142(3):321-346.

6. Wolff AC, Hammond MEH, Allison KH, et al. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Clinical Practice Guideline Focused Update. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2018;142(11):1364-1382.

7. Mosele F, Remon J, Mateo J, et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Annals of Oncology. 2020;31(11):1491-1505.

8. Chakravarty D, Johnson A, Sklar J, et al. Somatic Genomic Testing in Patients With Metastatic or Advanced Cancer: ASCO Provisional Clinical Opinion. Journal of Clinical Oncology. 2022;40(11):1231-1258.