Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – Sanger sequencing là gì?

Khi tìm hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư, bác có thể gặp nhiều thuật ngữ như PCR, RT-PCR, FISH, Sanger sequencing và NGS. Mỗi kỹ thuật có một cách hoạt động và phạm vi ứng dụng khác nhau. Trong đó, Sanger sequencing là một trong những phương pháp giải trình tự DNA kinh điển và vẫn còn giá trị trong thực hành xét nghiệm sinh học phân tử hiện nay.

Nếu PCR giống như việc khuếch đại một đoạn DNA cần tìm, thì Sanger sequencing giống như việc đọc từng chữ cái trong đoạn DNA đó để xác định chính xác trình tự A, T, G và C.

Trong ung thư học, Sanger sequencing có thể được sử dụng để xác định một số biến thể DNA cụ thể, đặc biệt khi vùng gene cần khảo sát đã được xác định tương đối rõ. Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp nếu bác sĩ muốn khảo sát đồng thời hàng chục hoặc hàng trăm gene với nhiều loại biến đổi khác nhau. Trong những tình huống như vậy, NGS thường có ưu thế hơn.

1. Sanger sequencing là gì?

Sanger sequencing, còn gọi là phương pháp giải trình tự chuỗi kết thúc, là một kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của DNA dựa trên nguyên lý sử dụng các nucleotide đặc biệt có khả năng kết thúc quá trình kéo dài chuỗi DNA.

DNA được cấu tạo từ bốn loại nucleotide chính là A, T, G và C. Trình tự của những nucleotide này chứa thông tin di truyền.

Ví dụ, một đoạn DNA có thể có trình tự:

ATGCTGAC...

Sanger sequencing giúp xác định chính xác thứ tự các nucleotide trong đoạn DNA được khảo sát.

Điểm quan trọng là Sanger sequencing không chỉ cho biết “có DNA hay không”, mà có thể đọc trình tự DNA để xem tại một vị trí cụ thể đang có nucleotide nào.

2. Vì sao gọi là “giải trình tự”?

“Giải trình tự” có nghĩa là xác định thứ tự sắp xếp của các nucleotide trong DNA.

Có thể hình dung DNA giống như một câu được viết bằng bốn chữ cái A, T, G và C.

Nếu PCR giúp photocopy một đoạn câu thành thật nhiều bản để dễ kiểm tra, thì giải trình tự giúp chúng ta đọc từng chữ cái của đoạn câu đó theo đúng thứ tự.

Trong ung thư học, điều này rất quan trọng vì một thay đổi chỉ xảy ra ở một nucleotide cũng có thể tạo thành một biến thể gene có ý nghĩa đối với bệnh hoặc điều trị.

3. Sanger sequencing hoạt động như thế nào?

Nguyên lý của Sanger sequencing dựa trên quá trình tổng hợp một mạch DNA mới dựa trên mạch DNA khuôn.

Phản ứng cần có DNA khuôn, primer, enzyme DNA polymerase và các nucleotide cần thiết.

Điểm đặc biệt là ngoài các nucleotide bình thường, phản ứng còn có những nucleotide được đánh dấu huỳnh quang và có khả năng chấm dứt quá trình kéo dài DNA.

Khi DNA polymerase tổng hợp mạch mới, tại một thời điểm nào đó, một nucleotide kết thúc được đưa vào. Quá trình kéo dài dừng lại tại vị trí đó.

Hàng loạt đoạn DNA có độ dài khác nhau được tạo ra. Các đoạn này sau đó được phân tách theo kích thước và tín hiệu huỳnh quang được đọc để xác định nucleotide cuối cùng của từng đoạn.

Từ toàn bộ các tín hiệu thu được, máy có thể tái dựng lại trình tự DNA của vùng được khảo sát.

4. Nucleotide kết thúc là gì?

Đây là thành phần quan trọng giúp Sanger sequencing hoạt động.

Trong quá trình tổng hợp DNA bình thường, nucleotide mới được thêm vào đầu mạch DNA và quá trình này tiếp tục kéo dài.

Các nucleotide kết thúc được sử dụng trong Sanger sequencing thiếu nhóm hóa học cần thiết để nucleotide tiếp theo tiếp tục được gắn vào. Vì vậy, khi nucleotide kết thúc được đưa vào, chuỗi DNA dừng kéo dài tại đó.

Các nucleotide kết thúc được đánh dấu bằng những màu huỳnh quang khác nhau tương ứng với A, T, G hoặc C.

Nhờ đó, khi máy đọc tín hiệu, nó có thể xác định nucleotide ở từng vị trí.

5. Sanger sequencing khác PCR như thế nào?

PCR và Sanger sequencing thường được nhắc đến cùng nhau nhưng chúng làm hai việc khác nhau.

PCR chủ yếu dùng để khuếch đại DNA.

Sanger sequencing dùng để xác định trình tự DNA.

Trong một số quy trình xét nghiệm, PCR có thể được thực hiện trước để khuếch đại vùng gene cần khảo sát. Sau đó, sản phẩm PCR được đưa vào bước Sanger sequencing để đọc trình tự.

Vì vậy, hai kỹ thuật này có thể bổ sung cho nhau.

Có thể hình dung:

PCR = làm cho đoạn DNA cần khảo sát có thật nhiều bản sao.

Sanger sequencing = đọc trình tự của đoạn DNA đó.

6. Sanger sequencing có phát hiện đột biến gene không?

Có.

Đây là một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp.

Giả sử một gene bình thường tại một vị trí có nucleotide G, nhưng trong tế bào ung thư xuất hiện biến đổi thành A.

Nếu vùng gene đó được khuếch đại và giải trình tự bằng Sanger sequencing, kết quả có thể cho thấy sự thay đổi tại vị trí tương ứng.

Như vậy, Sanger sequencing có thể giúp xác định một biến thể cụ thể trong vùng DNA được khảo sát.

Tuy nhiên, phương pháp này phù hợp nhất khi vùng cần khảo sát đã được xác định trước hoặc số lượng vùng cần đọc tương đối nhỏ.

7. Sanger sequencing có thể tìm EGFR trong ung thư phổi không?

Có.

Về mặt kỹ thuật, Sanger sequencing có thể được sử dụng để phân tích các vùng của EGFR nhằm tìm một số biến thể.

Tuy nhiên, trong ung thư phổi hiện đại, Sanger sequencing không còn là lựa chọn tối ưu cho tất cả các tình huống xét nghiệm EGFR.

Lý do là EGFR có nhiều vùng và nhiều loại biến thể có thể có ý nghĩa điều trị. Một số biến thể quan trọng có thể được phát hiện bằng các phương pháp khác nhanh hơn hoặc nhạy hơn.

Nếu cần khảo sát đồng thời EGFR với nhiều gene khác như ALK, ROS1, BRAF, KRAS, MET, RET, NTRK và HER2, một panel NGS có thể cung cấp phạm vi khảo sát rộng hơn.

Vì vậy, việc sử dụng Sanger sequencing hay NGS phải dựa trên câu hỏi lâm sàng và mục tiêu xét nghiệm.

8. Sanger sequencing có phát hiện được EGFR exon 19 deletion không?

Có thể phát hiện được một số dạng mất đoạn trong vùng được khuếch đại, nhưng khả năng phát hiện phụ thuộc vào thiết kế xét nghiệm và đặc điểm của biến thể.

Đây là điểm quan trọng vì không phải mọi biến thể đều dễ dàng được phát hiện bằng Sanger sequencing.

Sanger sequencing đặc biệt hữu ích với các biến thể nằm trong vùng trình tự mà phương pháp có thể đọc rõ. Với những biến đổi phức tạp, biến thể có tỷ lệ alen thấp hoặc những vùng cần khảo sát rộng, các phương pháp khác có thể phù hợp hơn.

Trong thực hành, nếu mục tiêu là tìm nhiều biến thể EGFR cùng lúc, xét nghiệm NGS hoặc các phương pháp phân tử chuyên biệt thường có thể hiệu quả hơn.

9. Sanger sequencing có phát hiện được đột biến KRAS không?

Có.

Nếu biết vùng KRAS cần khảo sát, Sanger sequencing có thể được sử dụng để xác định trình tự của vùng đó và phát hiện một số biến thể.

Ví dụ, các biến thể tại codon 12 hoặc 13 của KRAS có thể được khảo sát bằng phương pháp giải trình tự phù hợp.

Tuy nhiên, nếu mục tiêu là khảo sát toàn diện KRAS cùng nhiều gene khác trong một mẫu ung thư, NGS thường có ưu thế hơn vì có thể phân tích nhiều vùng gene đồng thời.

10. Sanger sequencing có phát hiện được gene fusion không?

Thông thường, Sanger sequencing không phải phương pháp đầu tay để sàng lọc rộng gene fusion.

Một fusion có thể tạo ra nhiều dạng điểm nối khác nhau. Nếu đã biết chính xác fusion cần tìm và thiết kế xét nghiệm phù hợp, các phương pháp dựa trên PCR kết hợp giải trình tự có thể được sử dụng để xác nhận điểm nối.

Tuy nhiên, nếu chưa biết khối u có fusion nào và muốn tìm kiếm rộng nhiều fusion, Sanger sequencing không phải lựa chọn phù hợp.

Trong tình huống đó, NGS hoặc những kỹ thuật chuyên biệt cho fusion thường có giá trị hơn.

11. Sanger sequencing có phát hiện gene amplification không?

Sanger sequencing không phải phương pháp lý tưởng để đánh giá gene amplification.

Amplification là tình trạng số lượng bản sao của một gene tăng lên, trong khi Sanger sequencing chủ yếu được thiết kế để đọc trình tự nucleotide.

Nếu cần đánh giá số lượng bản sao gene, các phương pháp như FISH, các kỹ thuật định lượng hoặc một số phương pháp NGS phù hợp có thể được sử dụng tùy trường hợp.

Đây là ví dụ cho thấy “đột biến gene” và “bất thường số lượng bản sao gene” là hai vấn đề khác nhau và không phải kỹ thuật xét nghiệm nào cũng có thể trả lời cả hai.

12. Sanger sequencing có phát hiện được tất cả các loại đột biến không?

Không.

Sanger sequencing có thể phát hiện nhiều dạng biến thể trong vùng được đọc, nhưng khả năng phát hiện phụ thuộc vào loại biến thể, vị trí biến thể, chất lượng mẫu và thiết kế xét nghiệm.

Những biến thể nhỏ như một số thay đổi nucleotide hoặc các biến thể nhỏ trong vùng được khảo sát có thể được phát hiện khá tốt.

Tuy nhiên, các bất thường lớn hoặc phức tạp như một số rearrangement, fusion, thay đổi số lượng bản sao hoặc các biến thể nằm ngoài vùng được giải trình tự có thể cần phương pháp khác.

Do đó, không nên hiểu rằng:

“Sanger sequencing âm tính = gene hoàn toàn bình thường.”

Cách hiểu chính xác hơn là:

“Trong vùng DNA được giải trình tự, không phát hiện biến thể phù hợp với khả năng phát hiện của phương pháp.”

13. Sanger sequencing có nhạy không?

Sanger sequencing có độ chính xác cao khi đọc một trình tự DNA tương đối tinh sạch, nhưng độ nhạy để phát hiện một biến thể có tỷ lệ rất thấp không cao bằng nhiều phương pháp phân tử hiện đại.

Điều này đặc biệt quan trọng trong ung thư.

Một mẫu bệnh phẩm có thể chứa hỗn hợp tế bào ung thư và tế bào bình thường. Nếu một biến thể chỉ hiện diện ở một tỷ lệ rất nhỏ trong tổng lượng DNA, tín hiệu của biến thể có thể bị “lẫn” vào tín hiệu của trình tự bình thường.

Vì vậy, Sanger sequencing có thể bỏ sót một số biến thể có allele fraction thấp.

Các kỹ thuật như NGS hoặc một số phương pháp PCR chuyên biệt có thể có khả năng phát hiện những biến thể ở mức thấp tốt hơn, tùy thiết kế xét nghiệm.

14. VAF có ảnh hưởng đến khả năng phát hiện bằng Sanger sequencing không?

Có.

VAF (Variant Allele Frequency) là tỷ lệ DNA mang biến thể trong tổng số DNA được khảo sát tại vị trí đó.

Ví dụ, nếu trong một mẫu có khoảng 30% bản sao DNA tại một vị trí mang biến thể, tín hiệu của biến thể có thể tương đối rõ.

Nếu tỷ lệ này chỉ ở mức rất thấp, tín hiệu biến thể có thể khó phân biệt với nền của trình tự bình thường.

Đây là một trong những lý do kết quả Sanger sequencing cần được đánh giá trong bối cảnh chất lượng mẫu và tỷ lệ tế bào u.

Trong những trường hợp cần phát hiện biến thể ở mức rất thấp, bác sĩ có thể lựa chọn một phương pháp có độ nhạy phù hợp hơn.

15. Sanger sequencing khác NGS như thế nào?

Đây là điểm quan trọng nhất cần hiểu khi so sánh hai phương pháp.

Sanger sequencing thường đọc một đoạn DNA tương đối giới hạn trong mỗi phản ứng.

NGS có thể đọc đồng thời rất nhiều đoạn DNA trong một lần xét nghiệm.

Nếu bác sĩ đã biết chính xác vùng gene cần kiểm tra, Sanger sequencing có thể là một lựa chọn đơn giản và hiệu quả.

Nếu bác sĩ muốn khảo sát nhiều gene cùng lúc, NGS có ưu thế rất rõ.

Ví dụ, với một người bệnh ung thư phổi, thay vì lần lượt kiểm tra từng gene bằng những xét nghiệm riêng biệt, một panel NGS có thể đồng thời khảo sát nhiều gene và nhiều loại biến đổi tùy thiết kế.

Do đó, Sanger sequencing vẫn có vị trí riêng, nhưng NGS đã mở rộng đáng kể khả năng xét nghiệm phân tử trong ung thư học.

16. Vì sao Sanger sequencing vẫn còn được sử dụng?

Mặc dù NGS ngày càng phổ biến, Sanger sequencing chưa biến mất.

Phương pháp này có một số ưu điểm như độ chính xác cao trong vùng trình tự được đọc, quy trình tương đối dễ hiểu và phù hợp khi cần kiểm tra một vùng gene đã biết.

Một ứng dụng quan trọng là xác nhận một biến thể đã được phát hiện bằng phương pháp khác trong một số trường hợp phù hợp.

Ví dụ, nếu một xét nghiệm phát hiện một biến thể đáng chú ý và cần xác nhận bằng một phương pháp độc lập, Sanger sequencing có thể được sử dụng tùy hoàn cảnh.

Ngoài ung thư học, Sanger sequencing cũng vẫn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và xét nghiệm di truyền.

17. Một ví dụ để dễ hình dung

Giả sử bác sĩ nghi ngờ một biến thể tại một vùng cụ thể của gene.

Bước đầu tiên có thể là lấy DNA từ mẫu bệnh phẩm và dùng PCR để khuếch đại vùng gene cần khảo sát.

Sau khi có đủ DNA, sản phẩm PCR được đưa vào phản ứng Sanger sequencing.

Máy đọc các tín hiệu huỳnh quang và tạo ra một biểu đồ trình tự, trong đó mỗi đỉnh tương ứng với một nucleotide.

Nếu trình tự của mẫu giống trình tự tham chiếu, không phát hiện biến thể tại vùng đó.

Nếu xuất hiện thay đổi tại một vị trí, bác sĩ có thể nhận diện biến thể dựa trên sự thay đổi của trình tự hoặc hình thái tín hiệu.

Điều quan trọng là xét nghiệm chỉ cung cấp thông tin về vùng DNA đã được thiết kế để đọc.

Nếu một biến thể nằm ngoài vùng đó, Sanger sequencing sẽ không phát hiện được.

18. Biểu đồ Sanger sequencing là gì?

Kết quả Sanger sequencing thường được thể hiện dưới dạng một chromatogram, tức biểu đồ các tín hiệu huỳnh quang theo trình tự nucleotide.

Mỗi loại nucleotide được biểu diễn bằng một tín hiệu màu khác nhau.

Ở một trình tự tương đối sạch, các đỉnh thường rõ ràng và lần lượt tạo thành chuỗi nucleotide.

Nếu tại một vị trí chỉ có một nucleotide, biểu đồ thường xuất hiện một đỉnh chính tương ứng.

Nếu mẫu chứa hỗn hợp hai trình tự tại cùng vị trí, có thể xuất hiện hai tín hiệu chồng lên nhau.

Điều này có thể xảy ra khi một biến thể tồn tại cùng với allele bình thường trong mẫu.

Tuy nhiên, việc đọc chromatogram cần được thực hiện bởi người có chuyên môn và phải kết hợp với tiêu chuẩn phân tích của phòng xét nghiệm. Không nên tự nhìn một biểu đồ trên Internet rồi kết luận rằng một người có hay không có đột biến.

19. Sanger sequencing có thể làm từ máu không?

Có thể, nhưng việc sử dụng mẫu máu hay mô phụ thuộc vào câu hỏi xét nghiệm.

Nếu mục tiêu là tìm một biến thể di truyền, DNA từ máu có thể là nguồn bệnh phẩm phù hợp.

Nếu mục tiêu là tìm đột biến mắc phải của khối u, mẫu mô khối u thường có giá trị hơn vì biến thể có thể chỉ tồn tại trong tế bào ung thư.

Trong một số tình huống, DNA từ máu cũng có thể được sử dụng để khảo sát vật liệu di truyền có nguồn gốc từ khối u hoặc để phân biệt biến thể mắc phải với biến thể di truyền, tùy xét nghiệm.

Vì vậy, không thể chỉ dựa vào tên kỹ thuật để quyết định lấy máu hay lấy mô. Cần xác định trước đang tìm biến thể di truyền hay biến thể của khối u.

20. Sanger sequencing có dùng được trên mẫu mô ung thư không?

Có.

DNA được chiết xuất từ mô sinh thiết hoặc bệnh phẩm phẫu thuật có thể được sử dụng cho Sanger sequencing nếu chất lượng và lượng DNA đáp ứng yêu cầu.

Tuy nhiên, mẫu mô ung thư thường chứa cả tế bào ung thư và tế bào không phải ung thư. Vì vậy, tỷ lệ tế bào u trong mẫu có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện biến thể.

Nếu tỷ lệ tế bào u thấp hoặc biến thể chỉ tồn tại ở một tỷ lệ rất nhỏ, phương pháp có thể gặp giới hạn về độ nhạy.

Đây là lý do kết quả xét nghiệm gene luôn cần được đặt trong bối cảnh của chất lượng bệnh phẩm và tỷ lệ tế bào u, chứ không nên tách rời khỏi thông tin giải phẫu bệnh.

21. Sanger sequencing có thay thế được NGS không?

Không nên xem đây là hai phương pháp cạnh tranh trực tiếp trong mọi tình huống.

Sanger sequencing phù hợp khi câu hỏi xét nghiệm hẹp và cụ thể.

NGS phù hợp khi cần khảo sát rộng và đồng thời nhiều mục tiêu.

Ví dụ, nếu bác sĩ chỉ muốn xác nhận một biến thể cụ thể đã biết, Sanger sequencing có thể rất phù hợp.

Ngược lại, nếu một người bệnh ung thư phổi cần khảo sát nhiều gene để tìm các biến đổi có khả năng ảnh hưởng đến lựa chọn điều trị, NGS thường có nhiều lợi thế hơn.

Do đó, câu hỏi quan trọng không phải là “Sanger hay NGS tốt hơn?”, mà là:

“Với câu hỏi lâm sàng này, phương pháp nào cung cấp thông tin phù hợp nhất?”

22. Người bệnh nên hiểu kết quả Sanger sequencing như thế nào?

Khi thấy trên hồ sơ ghi Sanger sequencing, bác có thể hiểu rằng phòng xét nghiệm đang sử dụng một phương pháp giải trình tự để xác định trình tự DNA trong một vùng gene đã được lựa chọn.

Nếu kết quả phát hiện một biến thể, cần xem:

Gene nào?

Vị trí nào?

Biến thể thuộc loại gì?

Biến thể có ý nghĩa bệnh lý hoặc điều trị hay không?

Tỷ lệ biến thể và chất lượng mẫu có đáp ứng yêu cầu không?

Nếu kết quả không phát hiện biến thể, không nên hiểu ngay rằng toàn bộ gene hoàn toàn bình thường. Cần xem xét phạm vi vùng được giải trình tự và khả năng phát hiện của phương pháp.

Đặc biệt trong ung thư, một kết quả âm tính bằng Sanger sequencing không thể loại trừ tất cả các bất thường phân tử của khối u.

Kết luận

Sanger sequencing là phương pháp giải trình tự DNA kinh điển, giúp xác định chính xác thứ tự các nucleotide trong một vùng DNA được lựa chọn.

Trong ung thư học, phương pháp này có thể được sử dụng để phát hiện hoặc xác nhận một số biến thể gene khi vùng cần khảo sát đã được xác định rõ. Sanger sequencing đặc biệt hữu ích khi cần đọc một số vùng DNA tương đối giới hạn với độ chính xác cao.

Tuy nhiên, Sanger sequencing có những giới hạn quan trọng. Phương pháp không thích hợp để khảo sát đồng thời số lượng lớn gene và có thể hạn chế trong việc phát hiện các biến thể có tỷ lệ allele thấp hoặc những bất thường phân tử phức tạp. Nó cũng không phải phương pháp tối ưu để đánh giá mọi loại gene fusion, amplification hoặc các biến đổi cấu trúc lớn.

So với Sanger sequencing, NGS có khả năng khảo sát đồng thời nhiều gene và nhiều loại biến đổi hơn, vì vậy ngày càng được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm phân tử ung thư, đặc biệt khi cần tìm biomarker để lựa chọn điều trị đích.

Một điều bác cần nhớ là:

PCR giúp khuếch đại DNA.

Sanger sequencing giúp đọc trình tự DNA.

FISH giúp quan sát một số bất thường gene hoặc nhiễm sắc thể ngay trong tế bào.

NGS giúp khảo sát đồng thời nhiều vùng gene và nhiều loại biến đổi tùy theo thiết kế xét nghiệm.

Vì vậy, khi bác được chỉ định Sanger sequencing, điều quan trọng nhất không phải là nhớ tên kỹ thuật mà là hiểu xét nghiệm đang đọc vùng gene nào, nhằm tìm biến thể nào và kết quả đó có ý nghĩa gì đối với chẩn đoán hoặc điều trị.

Mời bác đọc bài tiếp theo: Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – Giải trình tự thế hệ mới NGS là gì?

Tài liệu tham khảo

1. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1977;74(12):5463-5467.

2. Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016;107(1):1-8.

3. National Human Genome Research Institute. DNA Sequencing Fact Sheet. National Human Genome Research Institute. Cập nhật hiện hành.

4. National Cancer Institute. DNA Sequencing. NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute. Cập nhật hiện hành.

5. Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, et al. Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2018;142(3):321-346.

6. Mosele F, Remon J, Mateo J, et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Annals of Oncology. 2020;31(11):1491-1505.

7. Chakravarty D, Johnson A, Sklar J, et al. Somatic Genomic Testing in Patients With Metastatic or Advanced Cancer: ASCO Provisional Clinical Opinion. Journal of Clinical Oncology. 2022;40(11):1231-1258.