Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – RT-PCR là gì?

Khi xem kết quả xét nghiệm sinh học phân tử, bác có thể bắt gặp những thuật ngữ như PCR, RT-PCR, real-time PCR hoặc qPCR. Chỉ khác nhau một vài chữ nhưng đây thực tế là những kỹ thuật có mục đích và nguyên lý không hoàn toàn giống nhau. Đặc biệt, chữ RT trong RT-PCR rất dễ gây nhầm lẫn, vì nó có thể khiến người đọc nghĩ rằng đây chỉ là một dạng PCR “nâng cao” hoặc một xét nghiệm có thể phát hiện mọi loại đột biến.

Thực tế, RT-PCR là một kỹ thuật trong đó RNA được chuyển đổi thành DNA bổ sung trước khi thực hiện PCR. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích khi cần nghiên cứu RNA, chẳng hạn phát hiện một số transcript bất thường, gene fusion hoặc đánh giá sự hiện diện của một RNA cụ thể. Trong ung thư học, RT-PCR có thể được sử dụng trong một số xét nghiệm sinh học phân tử, nhưng ý nghĩa của kết quả luôn phụ thuộc vào mục tiêu mà xét nghiệm được thiết kế để tìm.

Điều quan trọng là bác không nên chỉ nhìn thấy chữ “RT-PCR” rồi tự kết luận rằng xét nghiệm đã khảo sát toàn bộ gene của khối u. Muốn hiểu chính xác kết quả, cần biết xét nghiệm đang phân tích RNA hay DNA, tìm biến đổi nào và được thực hiện trên loại bệnh phẩm nào.

1. RT-PCR là gì?

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) có thể dịch là phản ứng chuỗi polymerase kết hợp với phiên mã ngược.

Điểm khác biệt cơ bản so với PCR thông thường nằm ở bước đầu tiên. PCR thông thường sử dụng DNA làm vật liệu khuôn để khuếch đại một vùng DNA đã được lựa chọn. Trong khi đó, RT-PCR bắt đầu từ RNA.

RNA được enzyme reverse transcriptase, tức enzyme phiên mã ngược, chuyển thành một dạng DNA gọi là cDNA (complementary DNA, DNA bổ sung). Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại vùng cần khảo sát.

Có thể hình dung đơn giản: nếu PCR thông thường bắt đầu bằng việc “phóng đại một đoạn DNA”, thì RT-PCR có thêm một bước trung gian là chuyển thông tin từ RNA sang DNA rồi mới phóng đại.

Vì vậy, chữ RT trong RT-PCR là viết tắt của Reverse Transcription, không phải “real-time”.

2. Vì sao RNA lại phải được chuyển thành DNA?

PCR được thiết kế để khuếch đại DNA. Trong khi đó, nhiều thông tin sinh học mà chúng ta muốn khảo sát lại tồn tại dưới dạng RNA.

RNA có thể phản ánh những gene đang được phiên mã trong tế bào và có thể chứa những transcript bất thường có giá trị trong chẩn đoán hoặc phân loại bệnh.

Tuy nhiên, RNA có đặc điểm hóa học khiến nó kém ổn định hơn DNA và không phải là vật liệu khuôn trực tiếp phù hợp cho PCR thông thường.

Do đó, trong RT-PCR, RNA được chuyển thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngược. Sau đó, cDNA trở thành khuôn cho PCR.

Quá trình này giúp phòng xét nghiệm sử dụng những ưu điểm của PCR để phát hiện một thông tin ban đầu nằm ở mức RNA.

3. RT-PCR hoạt động như thế nào?

Về cơ bản, RT-PCR có thể được hình dung qua hai giai đoạn.

Giai đoạn đầu là reverse transcription, tức phiên mã ngược. RNA trong mẫu bệnh phẩm được sử dụng làm khuôn để tạo ra cDNA.

Giai đoạn thứ hai là PCR amplification, tức khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase. Các primer được thiết kế để nhận diện vùng cDNA cần khảo sát. Sau nhiều chu kỳ khuếch đại, lượng DNA mục tiêu tăng lên đủ để hệ thống xét nghiệm phát hiện.

Nếu xét nghiệm được thiết kế để phát hiện một transcript cụ thể, RT-PCR sẽ cho biết transcript đó có được phát hiện trong mẫu hay không.

Nếu xét nghiệm được thiết kế để phát hiện một gene fusion, primer có thể được thiết kế ở hai vùng nằm trên hai gene khác nhau. Khi hai gene thực sự tạo thành một fusion transcript, phản ứng có thể khuếch đại đoạn RNA nối bất thường đó.

Đây là một ứng dụng đặc biệt quan trọng của RT-PCR trong một số bệnh lý ung thư và huyết học.

4. RT-PCR khác PCR thông thường như thế nào?

Điểm khác biệt dễ hiểu nhất là vật liệu ban đầu.

PCR thông thường chủ yếu bắt đầu từ DNA.

RT-PCR bắt đầu từ RNA, sau đó RNA được chuyển thành cDNA rồi mới thực hiện PCR.

Vì vậy, hai kỹ thuật có thể có những ứng dụng khác nhau.

Nếu bác sĩ muốn tìm một biến thể DNA cụ thể trong gene EGFR, một xét nghiệm PCR trên DNA có thể phù hợp.

Nếu cần khảo sát một RNA bất thường hoặc transcript tạo ra từ một gene fusion, RT-PCR có thể phù hợp hơn.

Điều này không có nghĩa RT-PCR “tốt hơn” PCR. Hai phương pháp được lựa chọn dựa trên câu hỏi xét nghiệm.

5. RT-PCR có phải là real-time PCR không?

Không. Đây là một trong những điểm dễ nhầm nhất.

Trong RT-PCR, chữ RT thường chỉ Reverse Transcription, tức phiên mã ngược.

Trong khi đó, real-time PCR mô tả cách tín hiệu PCR được theo dõi trong quá trình khuếch đại.

Hai khái niệm này nói về hai đặc điểm khác nhau của kỹ thuật.

Một xét nghiệm có thể vừa có bước phiên mã ngược vừa theo dõi tín hiệu khuếch đại theo thời gian thực. Khi đó có thể gặp thuật ngữ real-time RT-PCR hoặc RT-qPCR.

Vì vậy, khi đọc phiếu xét nghiệm, bác không nên đồng nhất “RT-PCR” với “real-time PCR”.

6. RT-qPCR là gì?

RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative PCR) là kỹ thuật kết hợp phiên mã ngược với PCR định lượng.

RNA được chuyển thành cDNA, sau đó quá trình khuếch đại được theo dõi bằng tín hiệu huỳnh quang theo từng chu kỳ. Từ đó, hệ thống có thể cung cấp thông tin về lượng RNA mục tiêu ban đầu trong những điều kiện xét nghiệm phù hợp.

RT-qPCR thường được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gene, phát hiện RNA của một tác nhân hoặc khảo sát những transcript cụ thể.

Trong ung thư học, nó có thể có ứng dụng trong một số xét nghiệm phân tử đặc hiệu. Tuy nhiên, ý nghĩa của các giá trị như Ct hoặc Cq phải được hiểu dựa trên phương pháp xét nghiệm cụ thể, chất lượng mẫu, ngưỡng phát hiện và tiêu chuẩn của phòng xét nghiệm.

Người bệnh không nên tự lấy một giá trị Ct hoặc Cq rồi suy ra rằng “Ct thấp là ung thư nặng hơn” hoặc “Ct cao là bệnh nhẹ hơn”. Những cách diễn giải như vậy có thể hoàn toàn sai nếu không biết xét nghiệm đang đo cái gì.

7. RT-PCR có thể phát hiện gene fusion không?

Có, trong những trường hợp xét nghiệm được thiết kế phù hợp.

Gene fusion là tình trạng hai vùng gene vốn nằm tách biệt bị nối với nhau do một biến đổi cấu trúc của DNA. Sự kiện này có thể tạo ra một fusion transcript, tức RNA bất thường được tạo ra từ hai gene đã hợp nhất.

RT-PCR có thể được thiết kế để nhận diện transcript này.

Ví dụ, trong một số bệnh ung thư, các gene fusion có thể tạo ra những protein bất thường thúc đẩy sự phát triển của tế bào ung thư. Nếu biết trước fusion cần tìm, phòng xét nghiệm có thể thiết kế primer để khuếch đại vùng nối đặc trưng.

Khi phát hiện được transcript phù hợp, kết quả có thể cung cấp bằng chứng quan trọng về sự hiện diện của fusion.

Tuy nhiên, cần nhớ rằng một xét nghiệm RT-PCR cụ thể chỉ tìm được những fusion hoặc transcript nằm trong phạm vi thiết kế của xét nghiệm.

Một kết quả âm tính không có nghĩa là khối u chắc chắn không có bất kỳ gene fusion nào.

8. RT-PCR có thể dùng để tìm đột biến DNA không?

Có thể trong một số hệ thống xét nghiệm kết hợp, nhưng cần phân biệt rõ.

RT-PCR về bản chất bắt đầu từ RNA. Nếu mục tiêu là một đột biến DNA, PCR trên DNA thường là cách tiếp cận trực tiếp hơn.

Tuy nhiên, một số đột biến DNA có thể dẫn đến thay đổi RNA hoặc tạo ra một transcript bất thường, và khi đó có thể khảo sát gián tiếp thông qua RNA bằng các kỹ thuật phù hợp.

Do đó, khi bác nhìn thấy tên xét nghiệm RT-PCR, không nên mặc định rằng nó đang tìm “đột biến gene” theo nghĩa thông thường. Cần xem mục tiêu phân tử cụ thể mà phòng xét nghiệm đang khảo sát.

9. RT-PCR có thể dùng để xét nghiệm ung thư phổi không?

Có thể, nhưng ứng dụng phụ thuộc vào câu hỏi lâm sàng và bộ xét nghiệm.

Trong ung thư phổi, nhiều biomarker quan trọng nằm ở DNA hoặc có dạng fusion/rearrangement. Một số xét nghiệm phân tử có thể sử dụng PCR hoặc RT-PCR để tìm những thay đổi đã được xác định trước.

Đặc biệt, RT-PCR có thể hữu ích khi cần phát hiện một số fusion transcript.

Tuy nhiên, nếu mục tiêu là khảo sát đồng thời nhiều gene và nhiều loại biến đổi như đột biến điểm, mất đoạn, chèn đoạn, amplification và fusion, một panel NGS được thiết kế phù hợp có thể cung cấp phạm vi khảo sát rộng hơn.

Điều này giải thích tại sao bác sĩ không chỉ hỏi “xét nghiệm PCR hay RT-PCR?” mà còn cần biết xét nghiệm đó khảo sát những biomarker nào.

10. RT-PCR có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm nào?

RT-PCR có thể được thực hiện trên các mẫu có chứa RNA phù hợp với mục tiêu xét nghiệm.

Trong ung thư, mẫu có thể là mô sinh thiết, bệnh phẩm phẫu thuật, một số mẫu tế bào học hoặc các loại mẫu khác tùy theo thiết kế xét nghiệm.

Chất lượng mẫu đặc biệt quan trọng vì RNA dễ bị phân hủy hơn DNA. Mẫu được bảo quản, xử lý không phù hợp có thể làm giảm chất lượng RNA và ảnh hưởng đến khả năng xét nghiệm.

Ngoài ra, lượng tế bào u trong mẫu cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện một transcript bất thường.

Do đó, một kết quả không phát hiện được mục tiêu không phải lúc nào cũng đơn giản có nghĩa là mục tiêu đó hoàn toàn không tồn tại trong khối u.

11. RT-PCR có thể thực hiện trên máu không?

Có thể trong một số xét nghiệm, tùy mục tiêu.

Nếu RNA hoặc vật liệu di truyền liên quan đến khối u có thể được thu nhận từ máu và xét nghiệm đã được xác lập cho loại mẫu này, RT-PCR có thể được sử dụng để khảo sát.

Tuy nhiên, trong ung thư, lượng vật liệu di truyền có nguồn gốc từ khối u trong máu có thể rất thấp. Vì vậy, khả năng phát hiện phụ thuộc vào loại bệnh, khối lượng bệnh, đặc điểm sinh học của khối u, chất lượng mẫu và độ nhạy của xét nghiệm.

Một kết quả âm tính trên máu vì thế không nhất thiết loại trừ hoàn toàn một bất thường phân tử trong mô khối u.

12. RT-PCR dương tính có nghĩa là gì?

Ý nghĩa của kết quả dương tính phụ thuộc hoàn toàn vào mục tiêu mà xét nghiệm đang tìm.

Nếu xét nghiệm được thiết kế để tìm một fusion transcript cụ thể và kết quả dương tính, điều đó cho thấy mẫu đã chứa tín hiệu phù hợp với transcript đó trong phạm vi phát hiện của xét nghiệm.

Nếu bất thường phân tử này có ý nghĩa trong chẩn đoán hoặc điều trị, bác sĩ có thể sử dụng kết quả như một phần của quá trình ra quyết định.

Nhưng kết quả RT-PCR dương tính không nên được hiểu một cách máy móc là “đã xác định ung thư” hoặc “chắc chắn có thuốc điều trị”.

Trong nhiều tình huống, kết quả cần được đối chiếu với giải phẫu bệnh, đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm phân tử khác.

13. RT-PCR âm tính có nghĩa là không có bất thường gene không?

Không.

Đây là một nguyên tắc rất quan trọng khi đọc xét nghiệm sinh học phân tử.

Nếu RT-PCR được thiết kế để tìm một transcript cụ thể và kết quả âm tính, điều đó chủ yếu có nghĩa là không phát hiện được transcript mục tiêu trong mẫu bằng phương pháp và điều kiện xét nghiệm đó.

Có thể có nhiều lý do khiến một bất thường không được phát hiện, chẳng hạn mẫu không chứa đủ tế bào u, RNA bị phân hủy, lượng transcript thấp hoặc bất thường phân tử nằm ngoài phạm vi mà xét nghiệm có thể nhận diện.

Ngoài ra, một xét nghiệm RT-PCR chỉ khảo sát một nhóm mục tiêu nhất định không thể loại trừ tất cả các biến đổi phân tử khác.

Vì vậy, không nên viết phương trình suy luận đơn giản:

RT-PCR âm tính = không có đột biến.

Cách hiểu đúng phải là:

RT-PCR âm tính = không phát hiện mục tiêu mà xét nghiệm được thiết kế để tìm trong mẫu đã phân tích.

14. RT-PCR có thay thế được NGS không?

Thông thường không thể nói một phương pháp thay thế hoàn toàn phương pháp kia.

RT-PCR có ưu thế khi cần tìm một mục tiêu đã xác định, đặc biệt khi mục tiêu đó có thể được nhận diện bằng một hệ thống primer phù hợp.

NGS có thể khảo sát đồng thời nhiều gene và nhiều loại biến đổi tùy theo thiết kế của panel.

Trong thực hành ung thư học, bác sĩ có thể lựa chọn RT-PCR, PCR, FISH, giải trình tự hoặc NGS dựa trên loại ung thư và biomarker cần tìm.

Một xét nghiệm đơn mục tiêu có thể nhanh và hiệu quả khi câu hỏi đã rõ. Ngược lại, khi chưa biết khối u có bất thường nào và cần khảo sát nhiều khả năng, xét nghiệm diện rộng có thể phù hợp hơn.

15. Vì sao cùng là xét nghiệm gen nhưng phải dùng những kỹ thuật khác nhau?

Bởi vì “xét nghiệm gen” không phải là một xét nghiệm duy nhất.

DNA và RNA mang những loại thông tin khác nhau. Các dạng biến đổi phân tử cũng rất đa dạng.

Một đột biến điểm có thể được khảo sát bằng PCR hoặc giải trình tự tùy trường hợp. Một số fusion có thể được phát hiện bằng RT-PCR hoặc FISH. Những thay đổi phức tạp hơn có thể cần một phương pháp khác.

Do đó, lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm phải bắt đầu từ câu hỏi:

“Bác sĩ cần tìm bất thường phân tử nào?”

Sau đó mới lựa chọn phương pháp phù hợp để trả lời câu hỏi đó.

Đây cũng là lý do một xét nghiệm có tên rất “hiện đại” chưa chắc đã cung cấp nhiều thông tin hơn một xét nghiệm đơn giản. Giá trị của xét nghiệm nằm ở sự phù hợp giữa phương pháp, mục tiêu cần tìm và tình huống lâm sàng.

16. Một ví dụ để dễ hình dung

Giả sử một người bệnh được chẩn đoán ung thư và bác sĩ nghi ngờ một bất thường phân tử tạo ra một fusion transcript cụ thể.

Nếu xét nghiệm được thiết kế để tìm đúng fusion đó, RT-PCR có thể được sử dụng để khảo sát RNA trong mẫu bệnh phẩm. RNA được chuyển thành cDNA, sau đó vùng chứa điểm nối của fusion được khuếch đại và phát hiện.

Nếu kết quả dương tính, bác sĩ có thêm bằng chứng về sự hiện diện của fusion mục tiêu.

Nếu kết quả âm tính, bác sĩ sẽ không thể chỉ dựa vào đó để khẳng định rằng khối u hoàn toàn không có bất kỳ gene fusion nào. Cần xem xét phạm vi của xét nghiệm, chất lượng mẫu và liệu có cần một phương pháp khác để khảo sát rộng hơn hay không.

Ví dụ này cho thấy một điều quan trọng: RT-PCR trả lời một câu hỏi phân tử cụ thể, chứ không phải trả lời toàn bộ câu hỏi về bộ gene của khối u.

17. Người bệnh nên hiểu RT-PCR như thế nào khi đọc hồ sơ?

Nếu trên phiếu xét nghiệm ghi RT-PCR, bác có thể hiểu rằng xét nghiệm có một bước phiên mã ngược từ RNA thành cDNA, sau đó cDNA được khuếch đại bằng PCR.

Nếu mục tiêu là một transcript hoặc fusion cụ thể, kết quả cho biết mục tiêu đó có được phát hiện hay không trong phạm vi của xét nghiệm.

Nếu thấy RT-qPCR, xét nghiệm có thêm cơ chế định lượng dựa trên việc theo dõi tín hiệu khuếch đại.

Điều quan trọng nhất vẫn là xem tên xét nghiệm đầy đủ và mục tiêu phân tử cụ thể. Không nên chỉ dựa vào chữ “RT-PCR” để suy đoán xét nghiệm đã khảo sát bao nhiêu gene hoặc có thể loại trừ những bất thường nào.

Nếu bác được tư vấn làm RT-PCR, có thể hỏi bác sĩ: “Xét nghiệm này đang tìm RNA, fusion hay bất thường phân tử nào?” và “Nếu kết quả âm tính thì còn những bất thường nào mà xét nghiệm này chưa khảo sát?”

Hai câu hỏi này giúp bác hiểu rõ hơn giá trị thực sự của kết quả thay vì chỉ nhìn vào chữ dương tính hoặc âm tính.

Kết luận

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật kết hợp bước phiên mã ngược RNA thành cDNA với quá trình khuếch đại bằng PCR. Nhờ đó, phòng xét nghiệm có thể khảo sát những thông tin phân tử tồn tại ở mức RNA.

Trong ung thư học, RT-PCR có thể được sử dụng để phát hiện một số transcript bất thường, đặc biệt là một số gene fusion hoặc biến đổi phân tử đã được xác định trước. Kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao khi mục tiêu xét nghiệm đã rõ, nhưng phạm vi phát hiện phụ thuộc vào thiết kế của từng bộ xét nghiệm.

Cần đặc biệt phân biệt RT-PCR với real-time PCR. Chữ RT thường có nghĩa là Reverse Transcription, trong khi real-time PCR mô tả cách tín hiệu khuếch đại được theo dõi trong quá trình phản ứng. Một xét nghiệm có thể kết hợp cả hai đặc điểm và được gọi là RT-qPCR.

Một kết quả RT-PCR âm tính cũng không có nghĩa là khối u hoàn toàn không có bất thường gene. Nó chỉ cho biết mục tiêu mà xét nghiệm được thiết kế để tìm không được phát hiện trong mẫu đã phân tích, trong những điều kiện của phương pháp đó.

Điều quan trọng không phải là nhớ tên của từng kỹ thuật, mà là hiểu xét nghiệm đang tìm thông tin gì, trên loại vật liệu di truyền nào, bằng phương pháp nào và kết quả đó có thể trả lời được câu hỏi lâm sàng nào.

Mời bác đọc bài tiếp theo: Hiểu về xét nghiệm gen trong ung thư – FISH là gì?

Tài liệu tham khảo

1. National Human Genome Research Institute. Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute. Cập nhật hiện hành.

2. National Cancer Institute. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute. Cập nhật hiện hành.

3. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.

4. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006;27(2-3):95-125.

5. Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, et al. Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2018;142(3):321-346.

6. Mosele F, Remon J, Mateo J, et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Annals of Oncology. 2020;31(11):1491-1505.

7. Chakravarty D, Johnson A, Sklar J, et al. Somatic Genomic Testing in Patients With Metastatic or Advanced Cancer: ASCO Provisional Clinical Opinion. Journal of Clinical Oncology. 2022;40(11):1231-1258.